對于液相色譜工作者來說，想要保證液相色譜實驗的順利進行，除了確保手上有一支合適的色譜柱之外，選擇和配置好實驗流動相也是成敗的關鍵因素。通常，用于反相 LC 的流動相可以是純溶劑、混合溶劑或含有緩沖液和添加劑的溶劑。而實際的流動相配置中有數百種溶劑可供選擇，因此配置出符合需求的流動相變得具有挑戰性。本期，我們將從流動相的溶劑特性、緩沖液和添加劑選擇以及色譜技術對流動相的需求趨勢展開介紹。

流動相溶劑特性

流動相的一些特性可以幫助我們為反相分析選擇正確的流動相組成。這些特性包括：

• 溶劑純度——在 LC 中選擇作為流動相的溶劑應為 色譜純度或質譜級純度，應進行過濾和超聲處理，以確保 UV 光譜中的吸光度最小且不含氣泡。

• 溶劑粘度——反相流動相應為最佳粘度，以幫助確保通過HPLC 柱固定相的最佳線速度，從而提供更窄和更尖銳的峰，因而提高分析的整體靈敏度。

• 折光率——這是使用示差折光檢測器時的一個關鍵考慮因素。理想情況下，當使用示差檢測器時，流動相和樣品溶劑應具有相似的折射率以避免出現負峰，換句話說，樣品應在流動相中制備。

• 溶劑沸點——最好選擇沸點低的溶劑以提高回收率，特別是在LC-MS 中，揮發性更強的溶劑將改善離子化，從而提高MS 靈敏度。

• 無腐蝕性——流動相溶劑不得腐蝕流路中的 HPLC 管、泵閥、密封件和其他部件。

• 溶劑毒性——確保溶劑無毒并且應使用穩定狀態下的溶劑。

• 溶劑混溶性——選擇與樣品混溶的溶劑。分析物也必須可溶。否則，在色譜柱入口篩板處將產生樣品沉淀，從而引發高背壓、基線問題、導致分析物峰靈敏度較低以及色譜圖中峰面積和峰形問題。

• 流動相透光度——選擇一種在檢測波長下可以透射的流動相。

• 洗脫強度——這是溶劑從固定相中洗脫目標分析物的能力。洗脫強度越高，溶劑越有效，選擇性越好。流動相溶劑應具有最佳和足夠的洗脫強度，以實現對目標分析物的選擇性。

考慮到這些特性，大多數色譜工作者的流動相溶劑是乙腈，因為它具有最佳粘度、良好的 UV 吸光度和足夠的洗脫強度。

其他常見的溶劑包括甲醇，甲醇的粘度比乙腈高（特別是與水混合時），還有四氫呋喃，它具有高洗脫強度，但因為毒性更大從而存在安全問題。甲基叔丁基醚可作為四氫呋喃的替代品。

選擇流動相緩沖液和添加劑

除了選擇流動相溶劑外，還需要選擇合適的緩沖液和/或其他添加劑。緩沖液用于控制流動相的 pH 值。酸性添加劑（pH 為 2 至 4）用于大多數制藥應用，而堿性流動相（pH 大于 8）用于為堿性分析物實現更高的保留和改善的峰形。

簡化的流動相，實驗最佳的選擇

為反相 LC 選擇更簡單的流動相已成為常態。這背后的實用性顯而易見，隨著色譜柱固定相和色譜柱制造技術的進步以及高靈敏度、高分辨率儀器的可及性，減少了對緩沖液和其他添加劑的需求，而這些需求在以前是得到良好色譜所必需的條件。

例如，傳統上將乙腈與 95% 的水混合以通過確保兩種流動相在粘度和表面張力方面相似度來提高混合效率。然而，隨著泵的改進和在線混合器的引入，這種需求變得不再必要。

除此之外，隨著使用具有線性梯度分布的更簡單的溶劑，方法變得更加穩健，并且隨著高分辨率質譜技術的快速發展，進一步減少了 LC 方法中對復雜流動相的需求。