【MDS Express】SEC保駕護(hù)航雙抗純化工藝

更新時(shí)間：2025-06-27

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雙特異性抗體（bispecific antibody,BsAb）是指含有兩種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗體，可以同時(shí)與靶細(xì)胞和功能細(xì)胞進(jìn)行相互作用，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞殺傷功能。近年，雙抗迎來研發(fā)熱潮，截至2024年底，全球已有19款雙抗藥物獲批上市，在研雙抗藥物數(shù)量達(dá)數(shù)百款。雙抗主要通過基因重組技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，有多種多樣的分子設(shè)計(jì)類型，滿足雙抗分子識(shí)別兩種不同抗原的能力。

其中IgG-like 的雙特導(dǎo)性抗體在表達(dá)中，理論上會(huì)伴隨產(chǎn)生10種以上的副產(chǎn)物，主要包括重鏈之間錯(cuò)配引起的同源抗體（homodimer Fc species）輕鏈與重鏈之間錯(cuò)配引起的異源抗體（heterodimeric Fc species）結(jié)構(gòu)不完整的片段抗體、如半抗（half antibody）或3/4抗體、以及輕鏈聚集體（light chain dimer）重鏈聚集體（heavy chain dimer）等等。參見示意圖1。

圖1. 雙特異性 mAb 表達(dá)中輕重鏈區(qū)域的可能組合

科學(xué)家們已經(jīng)找出多種巧妙的分子設(shè)計(jì)策略來降低上述副產(chǎn)物的產(chǎn)生。其中，經(jīng)典的要屬降低重鏈同源錯(cuò)配的 KiH，即 Knob-into-hole 技術(shù)，以及降低輕鏈重鏈錯(cuò)配的 CrossMab 技術(shù)。然而，所有分子設(shè)計(jì)策路都只能盡量降低某類副產(chǎn)物的產(chǎn)生，而不能消除全部的副產(chǎn)物。不僅如此，在雙抗的重組表達(dá)過程，還不可避免的會(huì)產(chǎn)生不完整的片段抗體以及聚集體。所有這些都給雙抗分子的下游工藝開發(fā)提出了挑戰(zhàn)。

面對(duì)這個(gè)問題，Biozen dSEC2色譜柱嘗試通過對(duì)一種lgG-like類型雙抗分子（Vudalimab）進(jìn)行純度分析，嘗試分離幾類主要的副產(chǎn)物，比如homodimer, half antibody, light chain related impurity aggregate 等^[1]。

Vudalimab （分子量約 125.43 kDa）是一種YBODY^®平臺(tái)工藝生產(chǎn)的二價(jià)（1:1）非對(duì)稱性的結(jié)構(gòu); 具體為靶向抗原A的單元Fab-Fc和靶向抗原B的單鏈單元ScFv-Fc 組成 (Fab-ScFv-Fc) （參見圖2）。單元A和單元B在二者Fc-CH3之間通過鹽橋（Salt-Bridge）和“杵入臼"（Knob-into-Hole）等工程改造以有效形成目標(biāo)雙抗體（heterodimer），并在鉸鏈區(qū)（hinge region）形成穩(wěn)定的鏈間二硫鍵。這些對(duì)Fc 的工程改造大大提高了目標(biāo)雙抗分子的占比，保證了雙抗體生產(chǎn)的高產(chǎn)率以及工藝和產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

圖2. Vudalimab PD-1 × CTLA-4 雙抗示意圖^[2]

在Biozen dSEC-2（3um，7.8x300mm）色譜柱上的分析結(jié)果可見：通過和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，Vudalimab的洗脫時(shí)間略晚于分子量150kDa的human IgG的洗脫時(shí)間；放大看Vudalimab的HMWS部分可以看到有至少三種不同分子量分布。推測(cè)為Homodimer錯(cuò)配，目標(biāo)雙抗聚集體和Homodimer的聚集體等。參見圖3。

圖3. Vudalimab的聚集體和Aqueous SEC check standard的疊圖

Biozen dSEC-2的高親水性改性的硅膠修飾技術(shù)結(jié)合鈦合金的柱硬件使得和生物大分子的次級(jí)作用得到改善，另外，dSEC-2有的孔控制技術(shù)也使得這款色譜柱具有柱床穩(wěn)定，耐壓，批次重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]. Cytiva：雙抗的純化策略

[2]. Mark N. Stein, et, al. A Phase 2 Study of Vudalimab, a PD-1 × CTLA-4 Bispecific Antibody, Plus Chemotherapy or Targeted Therapy in Patients with Molecularly Defined Subtypes of Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer.